中國研究者用羥基磷灰石納米粒作內耳基因治療新載體的體內外研究

6月25日消息，中國研究者研制了羥基磷灰石（hydroxyapatite，HAT）納米粒，評價其作為新的內耳基因轉染載體的可能性。

研究者用化學共沉淀-水熱合成法制備HAT載體。經DNA電泳做不同pH值和HAT含量的DNA結合實驗，了解HAT納米粒對DNA的結合和保護作用；用四甲基偶氮唑鹽法觀察HAT納米粒對宮頸癌上皮Hela細胞的毒性；用Hela細胞和小鼠耳蝸原代螺旋神經節細胞做神經營養素3（neurotrophin 3，NB）體外轉染實驗（綠色熒光蛋白基因熒光顯微鏡法）及NB的蛋白印跡分析，觀察HAT介導的NB基因對活細胞的體外轉染能力和基因表達情況；經實驗性興奮性耳毒性損傷豚鼠的耳蝸外淋巴腔灌注HAT納米載體-含增強型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）質粒載體-NT3基因復合物（HAT—pEGFPC2-NT3），用免疫組化（二氨基聯苯胺法）觀察NT3在耳蝸的表達，以了解HAT納米載體在活體動物耳蝸介導基因轉染的能力。

結果發現含量250．0μg／ml，pH值3～7是這種長約40～50nm的短棒狀HAT納米粒能完全結合重組質粒pEGFPC2-NT3的最低含量混懸液和最佳pH環境，并可有效保護基因不被核酸酶（DNase Ⅰ）破壞。四甲基偶氮唑鹽法觀察HAT納米粒從62．5μg／ml至500．0μg／ml4種混懸液對Hela細胞存活率無明顯影響，細胞形態無變化。EGFP熒光顯微鏡觀察顯示，HAT納米載體對Hela細胞的基因轉染率為15．7％±2．6％（-↑x±s）；將HAT—pEGFPC2-NT3轉染培養的小鼠耳蝸神經元，也可見明顯的EGFP表達。NT3免疫組化顯示，向實驗性興奮性耳蝸損害豚鼠的耳蝸外淋巴腔灌注HAT—pEGFPC2-NT3，可見活體耳蝸神經元內有明顯的NT3蛋白表達。

由此，研究者得出結論，HAT納米粒不僅可介導NT3基因的體外轉染，而且可介導其耳蝸活體轉染；盡管轉染率有待提高，但由于沒有病毒載體轉染造成的生物威脅，仍不失為一種很有研究價值的非病毒型內耳基因治療載體。